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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1869 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Einzelne Quantenpunkte (Qdots) werden häufig im Bereich der Einzelmolekülbildgebung verwendet. Qdots reagieren empfindlich auf Veränderungen in den physikalischen Wechselwirkungen zwischen den Qdots und den umgebenden Materialien. Die spektralen Änderungen in einer einzelnen Qdot-Emission wurden jedoch nicht im Detail untersucht. Eine Niedertemperatur-Plasmabehandlung von Glasoberflächen verringerte die Intensität des 655-nm-Emissionspeaks von Qdot655 auf Glasoberflächen, veränderte jedoch die Intensität der 580-nm-Emission nicht wesentlich. Durch die Silanisierung der Glasoberfläche erhöht sich die Dicke der Silanschicht und der Emissionspeak bei 655 nm nimmt zu. Wenn einzelne Qdots auf dem unbehandelten Glas abgebildet wurden, verringerte die Plasmabehandlung die Intensität der roten Emission und erhöhte die gelbe Emission. Wenn Qdots im Bereich von 28–0 nm nahe an die Glasoberfläche gebracht wurden, nahm die Intensität der roten Emission ab und die Intensität der gelben Emission nahm leicht zu. Bei der Markierung einzelner Aktinfilamente mit Qdots wurden Schwankungen der gelben und roten Emission des Qdots festgestellt, die die sehr geringen Abstandsänderungen widerspiegelten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die lokale Wechselwirkung von Qdots mit der Glasoberfläche die räumliche und zeitliche Auflösung optischer Messungen von mit Qdots markierten Biomolekülen verbessert.

Es wurde gezeigt, dass halbleitende Quantenpunkte (Qdots) mehrere photophysikalische Eigenschaften besitzen, die denen organischer Fluorophore überlegen sind: hohe Absorptionsquerschnitte, ausgezeichnete Photostabilität, breite Anregungsspektren und schmale Emissionsspektren1. Es wurden mehrere Peaks in den Emissionsspektren von Qdots mit einer einzigen Lichtquelle berichtet2,3. Diese Peaks werden auf unterschiedliche Weise beeinflusst, z. B. durch die Kopplung von Kern-Schale4, chemischen Verbindungen5, Ionen6,7, Luft-Wasser-Oberflächengrenzfläche8 und Oberflächenplasmonenresonanz9. Die Löschung von Qdots (CdSe) durch Goldnanopartikel in der Nähe wurde detailliert untersucht; der für die Löschung erforderliche Abstand wird auf 7,5 nm geschätzt. Diese Berichte stützen die Idee, dass Qdots empfindlich auf Veränderungen im umgebenden Medium, chemische Verbindungen oder physikalische Wechselwirkungen zwischen der Oberfläche von Qdots und der Umgebung (oder den umgebenden Materialien) reagieren. Die spektrale Änderung einzelner Q-Punkte kann durch Änderungen in der Größe der Q-Punkte und die Bildung von Emissionsdefektstellen auftreten. Im Falle der Defektbildung sollte ein breites Emissionsspektrum der Defektstelle bei längeren Wellenlängen im Vergleich zur Bandkantenemission (normalerweise der Hauptemissionspeak) beobachtet werden10. Die Photolumineszenzlöschung der Qdots wird auf mehrere Mechanismen zurückgeführt, darunter nichtradioaktive Rekombinationswege, innere Filtereffekte, Elektronentransferprozesse und Bindungswechselwirkungen3,11,12,13. Eine frühere Studie14 berichtet über die Löschung von Qdots (CdSe) durch Goldnanopartikel auf Einzelmolekülebene; Der Peak des Photolumineszenzspektrums (520 nm) nahm ab, ohne dass es zu einer scheinbar längerwelligen, breiten Emission kam, und es wurde eine abstandsabhängige Löschung (ca. 7,5 nm) beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Löschung auf FRET zwischen Qdots und Nanogoldpartikeln zurückzuführen ist.

Die spektral aufgelöste Fluoreszenzbildgebung einzelner CdSe/ZnS-Qdots, die durch Elektrospray-Abscheidung unter negativer Vorspannung aufgeladen wurden, hat eine Nettoblauverschiebung in der Qdot-Emission ergeben15, und eine aktuelle Studie16 hat gezeigt, dass das Spektrum aus mehreren Komponenten besteht und eine bestimmte Komponente selektiv ist beeinflusst durch den Elektronentransfer vom Qdot zu den Oberflächenmaterialien. Diese Studien legen nahe, dass sich die Spektren von Qdots durch die Glasoberflächenbehandlung und durch den Abstand zwischen Qdot und Glasoberfläche verändern können. Durch die Plasmabehandlung der Glasoberfläche werden die adsorbierten organischen Stoffe und Staubpartikel mit einer Dicke von einigen nm entfernt und das Glasoberflächenatom wird mit Hydroxylgruppen abgeschlossen17, die die Qdots in der Nähe der Oberfläche löschen oder das Emissionsspektrum verändern können.

Die räumliche Auflösung der herkömmlichen Lichtmikroskopie mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur beträgt etwa 300 nm. Die Eindringtiefe der Total Internal Reflection Microscopy (TIRM) entlang der z-Achse beträgt etwa 100 nm 18. Die hochauflösende (20 nm) Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM) analysiert Tausende von Bildern einzelner Fluorophore pro Aufnahme, was Zeit erfordert -aufwändige Verfahren19. Daher könnten abstandsabhängige spektrale Änderungen in Qdots eine Möglichkeit bieten, die räumliche und zeitliche Auflösung optischer Messungen deutlich zu verbessern. Einzelne Qdots werden häufig im Bereich der Molekülbildgebung20 verwendet. Die spektrale Veränderung einzelner Qdots auf der Glasoberfläche wurde jedoch nicht im Detail untersucht, obwohl sie für die Bildgebung einzelner Moleküle im Bereich der Biophysik verwendet wurden.

In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung der Glasoberflächenbehandlung auf die Spektren von Streptavidin-konjugierten Qdots. Die von der Qdot-Oberfläche abhängigen Änderungen der Quantenpunktemission in einer einzelnen Qdot-Ebene wurden analysiert. Einzelne Aktinfilamente wurden mit den Qdots markiert und die spektralen Veränderungen der Qdot-Emission wurden erstmals analysiert, was darauf hindeutet, dass die lokale Wechselwirkung zwischen dem Qdot und der Glasoberfläche die räumliche und zeitliche Auflösung der optischen Messung von mit Qdots markierten Biomolekülen verbessert .

Änderungen in den Emissionsspektren von Qdots, die auf der plasmaexponierten Glasoberfläche plattiert waren, wurden untersucht, wie in Abb. 1 gezeigt. Qdot655 hatte einen Emissionsmaximum bei 655 nm, wenn es mit 530-nm-Licht angeregt wurde. Die Intensität bei 655 nm sank mit zunehmender Plasmabehandlungszeit auf 40 % der Kontrolle (keine Plasmabehandlung), während sich die Intensität zwischen 545 und 600 nm nicht signifikant änderte (Abb. 1). Es wurde keine offensichtliche langwellige Emission (länger als 655 nm) beobachtet und die Spitzenemissionswellenlänge (655 nm) wurde offensichtlich nicht verändert.

Die Wirkung der Glasoberflächenplasmabehandlung auf das Emissionsspektrum von QD655. (a) Emissionsspektrum von QD655 auf der Glasoberfläche bei verschiedenen Dauern der Plasmabehandlung. Anregung bei 530 nm. Obere schematische Darstellung des Aufbaus. Unterer Einschub, die Vergrößerung des gelben Teils des Spektrums. (b) Die Spitzenemissionsintensität von QD655 nimmt mit zunehmender Dauer der Plasmabehandlung ab (n = 3). Im Bild ändert sich die Emissionsintensität bei 580 nm mit zunehmender Dauer nicht. (c) Emissionsspektrum von Qdot655 auf der Glasoberfläche, die mit unterschiedlichen Konzentrationen des Silankopplungsmittels behandelt wurde. Anregung bei 530 nm. Der Einschub zeigt die Vergrößerung des gelben Teils des Spektrums. (d) Die Spitzenemissionsintensität von Qdot655 steigt mit zunehmender Konzentration des Silankopplungsmittels (n = 3), aber die Emissionsintensität bei 580 nm ändert sich nicht (Einschub). Die vertikalen Balken in (b) und (d) geben die Standardabweichung an.

Die Abschwächung des Maximums der Fluoreszenzemissionsspektren bei unterschiedlichen Dauern der Plasmabehandlung zeigte, dass die von der Bestrahlungsdauer abhängige Abschwächung nach 30 s ihr Maximum und nach 1–2 s die halbmaximale Abschwächung erreichte, während sich die Emissionsintensität bei 580 nm nicht änderte unter diesen Bedingungen (Abb. 1b). Nahezu die gleichen Änderungen in den Emissionsspektren von Qdots wurden für Qdot565, Qdot585, Qdot605 und Qdot705 beobachtet (Abbildung S1).

Eine Niedertemperatur-Plasmabehandlung kann die Benetzbarkeit der Glasoberfläche erhöhen21,22. Der Wasserkontaktwinkel (WCA) der Substrate betrug vor der Plasmabehandlung 44°, und die Plasmabehandlung reduzierte den WCA deutlich auf Werte unter 10°. Die Wirkung der Niederdruck-Plasmabehandlung auf den WCA hing von der Dauer der Plasmabehandlung ab, wie in Abb. 2C dargestellt. Die Qdot-Emission nahm mit zunehmender Benetzbarkeit der Glasoberfläche ab, wie in Abb. 2Cb dargestellt.

(A) Schematische Darstellung des Kontaktwinkels (θ) und der Messung von θ1. (B) Eine Seitenansicht des Wassertropfens (30 μl) auf unbehandeltem Glas (a) und auf Glas mit Niedertemperatur-Plasmabehandlung (30 s) (b). (C) (a) Die Beziehung zwischen dem Kontaktwinkel (θ) und der Dauer der Niedertemperatur-Plasmabehandlung (Kreis) und die Beziehung zwischen θ und der Konzentration des Silankopplungsmittels (Quadrat) (n = 3). (b) Die Beziehung zwischen dem Kontaktwinkel (θ) und der prozentualen Abnahme der Spitzenintensität des Emissionsspektrums von Qdot655. Zahlen geben die Dauer der Plasmabehandlung an. Die Dauer der Plasmabehandlung wird oberhalb der Symbole angezeigt.

Die TEM-Bildgebung zeigt, dass die Silanisierung die Dicke der Silanschicht (ca. 28 nm)23 und möglicherweise den Abstand zwischen Qdots und der plasmabehandelten Glasoberfläche erhöht. Der Emissionspeak bei 655 nm auf der plasmabehandelten Glasoberfläche nahm zu, indem die Konzentration des Silanisierungsmittels dosisabhängig erhöht wurde (Abb. 1C), und die Silanisierung erhöhte den Kontaktwinkel auf der Glasoberfläche (Abb. 2C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Oberflächenhydrophilie die Spitzenemission von Qdots beeinflusst, die Emission bei kürzeren Wellenlängen jedoch nicht.

Das im obigen Abschnitt erwähnte Spektrum der Qdots ist ein Ensemble der Spektren einzelner Qdots. Mit anderen Worten: Das Gesamtspektrum soll eine Überlagerung einzelner Qdots sein. Die Emission eines einzelnen Qdots wird häufig zur Analyse des Verhaltens biologischer Moleküle verwendet 20. Die Emissionsänderung einzelner Qdots wird in den folgenden Abschnitten untersucht, um den Mechanismus hinter der Spektrumsänderung zu untersuchen und ihre Verwendung bei der Bildgebung von Biomolekülen zu finden.

Die Änderungen der gelben (Photolumineszenz durch einen optischen Bandpassfilter 550–614 nm, zentriert bei 582 nm, kurzwelliger Fuß des Emissionsprofils) und roten (642–708 nm, zentriert bei 675 nm) Intensitäten der Es wurden Emissionsspektren eines einzelnen Quantenpunkts auf der plasmabelichteten Glasoberfläche untersucht, wie in Abb. 3 gezeigt. Wie in Abb. 1 gezeigt, entsprechen die gelben und roten Emissionsintensitäten dem Teil des Spektrums, der eine niedrige und hohe Empfindlichkeit aufweist zur Modifizierung der Glasoberfläche (Plasmabehandlung und Silanisierung). Als einzelne Qdots auf dem unbehandelten Glas (ohne Plasmabehandlung) mit einem TIRF-Mikroskop abgebildet wurden, war die Intensität der roten Emission im Vergleich zu der der gelben Emission hoch. Wenn die Glasoberfläche mit dem Niederdruckplasma behandelt wurde, nahm die Intensität der roten Emissionsintensität ab, während sich die gelbe Emissionsintensität nicht merklich änderte. Die Abnahme der Rotintensität war abhängig von der Dauer der Plasmabehandlung (Abb. 3). Das Verhältnis der roten/gelben Emissionsintensität verringerte sich von 2,2 auf 0,6, was eine ähnliche Änderungstendenz wie die Emissionsspektren von Qdot655 zeigte (Abb. 1).

Single-Qdot-Analyse der Wirkung der Niedertemperatur-Plasmabehandlung. (A) Bilder von Qdot655 bei verschiedenen Dauern der Plasmabehandlung (0–30 s) durch den Rotfilter (a, mittlere Wellenlänge 675 nm) und den gelben Filter (b, mittlere Wellenlänge 582 nm). Die Pfeile zeigen auf den einzelnen in (c) gemessenen Qdot. (c) Intensitätsprofil des Qdot in den Feldern (a) und (b). (B) Die Emissionsintensität ändert sich abhängig von der Dauer der Plasmabehandlung. (a) gelbe Emissionsintensität, (b) rote Emissionsintensität und (c) Verhältnis der gelben und roten Emissionsintensitäten. Stäbe, 5 μm.

Die Silanisierung der Glasoberfläche erhöhte die rote Emissionsintensität einer einzelnen Qdot655-Emission auf der plasmabehandelten Glasoberfläche, während sich die gelbe Emissionsintensität nicht merklich änderte (Abb. 4). Dieser Silanisierungseffekt war abhängig von der Konzentration des Silanisierungsmittels (Abb. 4B). Somit änderten sich die roten und gelben Emissionsintensitäten eines einzelnen Qdots entsprechend der Plasmabehandlung und Silanisierung in entgegengesetzter Weise zu den spektralen Änderungen in Abb. 1.

Einzel-Qdot-Analyse der Wirkung einer Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen des Silan-Haftvermittlers. (A) Bilder von Qdot655 bei unterschiedlichen Konzentrationen des Silankopplungsmittels durch den Rotfilter (a, mittlere Wellenlänge 675 nm) und den gelben Filter (b, mittlere Wellenlänge 582 nm). Die Pfeile zeigen auf den in (c) gemessenen Qdot. (c) Intensitätsprofil des Qdot in (a) und (b). (B) Die Emissionsintensität ändert sich abhängig vom Prozentsatz des Wirkstoffs. (a) gelbe Emissionsintensität, (b) rote Emissionsintensität und (c) Verhältnis der gelben und roten Emissionsintensitäten. Die Notation dieser Abbildung ist die gleiche wie in Abb. 3.

Die Intensitäten der einzelnen Qdots waren unterschiedlich, wie in den Abbildungen dargestellt. 3 und 4, vermutlich weil (1) der Abstand zwischen den einzelnen Qdots und der Glasoberfläche unterschiedlich war, (2) die Anzahl der Qdots im einzelnen Spot unterschiedlich war und (3) die Längsachse der einzelnen Qdots nicht unterschiedlich war identisch mit der Polarisationsachse der Laserbeleuchtung. Die gelbe und rote Intensität der Flecken veränderte sich jedoch auf die gleiche Weise, wie in Abb. 3 und 4 dargestellt. Einzelne Qdots zeigten ein Blinken. Das Blinken der roten und gelben Emissionsintensitäten wurde in der β-Mercaptoethanol-freien Lösung beobachtet und sie blinkten synchron. Es wurde auch ein gleichzeitiges Abschrecken beider festgestellt. Diese Beobachtungen sind aus Ensemblemessungen vieler Qdots mit einem Fluorospektrometer nicht ersichtlich.

Die abstandsabhängigen Änderungen der Emissionsintensität von Qdot655 wurden durch Verschieben von Qdots von einer plasmabehandelten (30 s) Glasoberfläche untersucht. Die Position einer kleinen Anzahl von Qdots an der Spitze der Glaskapillare wurde mithilfe eines Piezoaktors geändert (Abb. 5B Einschub), die Qdots wurden durch die interne Totalreflexion von 532-nm-Laserlicht beleuchtet und die Positionsabhängige Änderung in Die Intensität der Emission wurde durch die gelben und roten Bandpassfilter erfasst. Die Amplitude der Verschiebung der Qdots an der Spitze der feinen Glaskapillare betrug 27,7 nm. Als sich die Spitze allmählich der Glasoberfläche näherte, nahm die Intensität der roten Emission ab, während die Amplitude der gelben zunahm (Abb. 5A). Ein ähnliches Experiment wurde mit der größeren Verschiebungsamplitude (60 nm) wiederholt. Als sich die Spitze der Glasoberfläche näherte, nahm die Intensität der gelben Emission zu. Auch die Intensität des Roten nahm bei Annäherung der Spitze an die Glasoberfläche von 60 auf ca. zu. 20 nm, nahm jedoch gegenüber dem Spitzenwert um 30–40 % ab, als es sich der Oberfläche näherte (20–0 nm) (Abb. 5C, rot schattiert). Die Intensität der Emission änderte sich in umgekehrter Weise, wenn sich der Qdot von der Oberfläche entfernte. Diese Änderungen wurden wiederholt beobachtet (die Spitze wurde jede Sekunde wiederholt um 60 nm auf und ab bewegt), was darauf hindeutet, dass die spektralen Änderungen der Qdots-Emission reversibel waren. Zusammengefasst nehmen die Intensitäten der gelben und roten Emissionen mit einer Raumkonstante für den exponentiellen Anstieg von ca. zu. 100 nm, wenn der Qdot im Bereich von 20–100 nm von der Glasoberfläche in das evaneszente Beleuchtungsfeld eintritt24. Die Intensität der roten Emission nahm ab, wenn die Qdots in den Bereich von 0–20 nm von der Oberfläche gelangten, die der gelben Emission jedoch nicht.

Abstandsabhängige Änderungen der Emissionsintensität von Qdot und Glasoberfläche. (A) oberes Feld zeigt die abstandsabhängige Abnahme der gelben Emissionsintensität der Emissionsintensität (Mittenwellenlänge 582 nm) und der roten Emissionsintensität (Mittenwellenlänge 675 nm). Die einfaktorielle ANOVA-Analyse zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen den Emissionsintensitäten (p < 0,01 für 582 nm) und (p < 0,05 für 675 nm), die mit zunehmendem Abstand zwischen dem QD und der Glasoberfläche abnahmen bzw. zunahmen (Abb. 5A). ). Die im oberen Diagramm von Abb. 5A dargestellte Abstandsabhängigkeit der 582-nm-Emissionsintensität könnte durch die räumliche Änderung der evaneszenten Lichtintensität (Raumkonstante der evaneszenten Welle, 100 nm) erklärt werden. Das Verhältnis zwischen den Emissionen bei 582 und 675 nm hängt hauptsächlich von der sehr kurzen Distanz (27 nm) abhängigen Löschung von Qdots ab. (B) Das Verhältnis der gelben/roten Emissionsintensität nimmt mit zunehmender Entfernung zu. Einschübe sind Bilder der Emission eines Qdots bei 28 nm darüber (links), auf der Oberfläche (Mitte) und 28 nm darüber (rechts) sowie eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. (C) Abstandsabhängige Änderungen der roten (rote Kreise) und gelben (schwarze Kreise) Emissionsintensitäten. Qdots wurden wiederholt jede Sekunde um 60 nm auf und ab bewegt. Die Spitze näherte sich zweimal von 60 nm über der Oberfläche der Oberfläche (0 nm). Die horizontale Achse zeigt die Position des Qdot von der Glasoberfläche und die vertikale Achse zeigt die Emissionsintensität von Qdot655. Der an der Spitze der Glaskapillare angebrachte Qdot würde seine Richtung nicht ändern, daher wird dieser Qdot zur Schätzung der abstandsabhängigen Änderungen der Emission verwendet. Die Spitze der Glaskapillare beeinflusst das evaneszente Feld. Die feine Glaskapillare (ungefähr 1 μm) wurde in Panel A verwendet und eine etwas größere Glaskapillare (ungefähr 2 μm) wurde in Panel C verwendet. Dieser Unterschied und die Richtung der Längsachse des Qdot an der Spitze der Kapillare würden die beeinflussen Signalpegel dieser Daten (mehr dazu in der Diskussion) und die Amplitude der Schwingung in den Feldern A und C.

Aktin ist das am häufigsten vorkommende Protein in den meisten eukaryotischen Zellen. Unsere aktuelle Studie legt nahe, dass das Cofilin-Protein (Aktinfilament-trennendes Protein) bevorzugt Aktinfilamente mit geringerer Spannung bindet und dass Aktinfilamente mit geringerer Spannung größere Schwankungen aufwiesen25 und eine positive Korrelation zwischen dem Fluktuationsindex und der On-Rate der Cofilin-Bindung aufwiesen wird berichtet18. Die Fluktuationen von Aktinfilamenten in der Nähe der Glasoberfläche wurden mit Qdots untersucht.

Aktinfilamente waren lose an der Glasoberfläche befestigt und spärlich mit Qdots markiert, wie in Abb. 6A gezeigt. In etwa 30 % der Zeitrafferdaten schwankte die gelbe und rote Emission gegenphasig, was darauf hindeutet, dass sich die mit einem Qdot markierte Aktin-Untereinheit der plasmaexponierten Glasoberfläche bei weniger als 20 nm näherte. In diesem Bereich (0 nm bis 20 nm) ändert sich die Intensität der roten und gelben Emission gegenphasig, wie in Abb. 5A dargestellt. Im übrigen Teil schwankten die gelben und roten Emissionen häufig gleichphasig (Abb. 6C), was darauf hindeutet, dass die Q-Punkte zwischen 20 und 100 nm durch evaneszentes Licht beleuchtet wurden (das Licht nahm von der Oberfläche mit einem Abstand allmählich ab). Konstante von ca. 100 nm). Somit können die Änderungen in der Intensität der gelben und roten Emissionsschwankungen eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung der Position eines Aktinfilaments über der Glasoberfläche liefern.

Änderungen der Emissionsintensität eines einzelnen Qdot655, das an einem Aktinfilament befestigt ist. (A)(a) Fluoreszenzbilder (10 μm × 10 μm) von Aktinfilamenten und Qdots durch einen Filter bei 582 nm und 675 nm. Der Pfeil zeigt den Qdot auf einem Aktinfilament vor der Rhodaminlöschung. Die Emissionsintensitäten des QD wurden nach dem Löschen der Rhodaminfluoreszenz des Filaments gemessen und sind in den Feldern B und C dargestellt. Eine schematische Darstellung des Aktinfilaments und des Emissionsspektrums eines Qdot entfernt vom Substrat (links) und in der Nähe die Oberfläche (rechts), beobachtet durch die roten (b) und gelben (c) Bandpfadfilter. (B) Beispiel der Spur, die gelbe (hintere Quadrate) und rote (rote Quadrate) Emissionsintensitäten der Emission zeigte, die sich gegenphasig änderten. (C) Typische zeitabhängige Änderungen in der Qdot655-Emission. Die schattierten Bereiche, die die Zeitspuren zeigen, zeigen die gegenphasigen Änderungen in den Intensitäten der gelben und roten Emissionsintensitäten. Der am weitesten rechts schattierte Bereich ist im Feld (B) vergrößert.

In dieser Studie nahm die Intensität des roten Emissionsspektrums (nahe 655 nm) von Qdots ab, wenn sich Qdots dem plasmabehandelten Glas näherten, und nahm zu, wenn die Oberfläche silanisiert wurde. Im Gegensatz dazu schien die gelbe Emissionsintensität des Spektrums durch diese Behandlungen nicht beeinflusst zu werden. Die Einzelpartikelanalyse von Qdots auf modifizierten Glasoberflächen stimmte im Wesentlichen mit der Spektralanalyse des Massenverhaltens von Qdots überein. Die direkte Manipulation von Qdots zeigte, dass die Intensität der roten Emissionsintensität abhängig von der Entfernung der Glasoberfläche (0–20 nm) abnahm, und die Abbildung einzelner Qdots, die an ein einzelnes Aktinfilament gebunden waren, verspricht eine hohe räumlich-zeitliche Abbildung markierter Biomoleküle mit Qdots nahe der Glasoberfläche.

Die direkte Manipulation und Verschiebung von Qdots von der plasmabehandelten Glasoberfläche lässt darauf schließen, dass der Oberflächeneffekt auf die rote Emissionsintensität abstandsabhängig mit der Raumkonstante (< 20 nm) abnimmt, die weitaus geringer ist als die Eindringtiefe von das evaneszente Feld (100 nm) oder die Wellenlänge des sichtbaren Lichts (400–700 nm). Die Intensität der gelben Emissionsintensität nahm leicht zu, als sich Qdots der Oberfläche näherten, vermutlich aufgrund der Zunahme der Intensität des evaneszenten Beleuchtungsfelds (Abb. 5A, oberes Feld).

Die Bildgebung von Qdots, die an ein einzelnes Aktinfilament gebunden waren, zeigte, dass die Intensität der gelben und roten Emission gegenphasig schwankte, was darauf hindeutet, dass das Qdot-markierte Aktinprotomer in der Nähe der Glasoberfläche (weniger als 20 nm von der Oberfläche entfernt) schwankte. Die Analyse der Qdot-Emission wird die räumlich-zeitliche Abbildung der Konformationsänderungen im Qdot-markierten Biomolekül ermöglichen. Diese Studie liefert eine wichtige Grundlage für die hochauflösende Bildgebung funktionierender biologischer Moleküle.

Die richtungsabhängigen Änderungen der Amplitude der Emission eines Fluorophors, z. B. Qdots, werden in der vorangegangenen Studie von Goldman YE und Kollegen26 berichtet; Sie schlugen außerdem eine Methode vor, um die Richtung des Fluorophors im 3D-Raum abzuschätzen. Die Richtung der Längsachse einzelner Qdots27 ist unterschiedlich und wird durch das polarisierte Laserlicht entlang der y-Achse beleuchtet, was den Qdot am effektivsten anregt, wenn die Qdot-Längsachse an der y-Achse ausgerichtet ist, und weniger effektiv, wenn sie an der ausgerichtet ist x-Achse. Dies würde die Photolumineszenzintensität einzelner Qdot unterschiedlich machen. Es wurde festgestellt, dass die Intensität der gelben und roten Emission unabhängig von der Photolumineszenzintensität (dh der Richtung der Längsachse der einzelnen Q-Punkte) ähnlich mit der Verschiebung variiert, wie in den Abbildungen gezeigt. 3 und 4. Wenn in Zukunft eine genaue Schätzung der Richtung der Längsachse des Qdot und eine gleichzeitige Messung der gelben und roten Emissionsintensitäten desselben Qdot durchgeführt werden, wird es möglich sein, den Abstand zwischen dem Qdot und quantitativ abzuschätzen der Glasoberfläche.

Die mit Niedertemperaturplasma behandelte Glasoberfläche enthält C-, O- und Si-Elemente, und die Oberflächenmorphologie des Glases hat sich nicht verändert21. Die verstärkende Wirkung von Niedertemperaturplasma auf den Wasserkontaktwinkel wird vermutlich hauptsächlich durch Hydroxyl- und Carboxylgruppen verursacht21. Die Plasmabehandlung verringerte in dieser Studie den Kontaktwinkel, was auf eine Zunahme der Dichte der Silanolgruppen hinweist28. Durch die Hydroxylierung der Oberfläche werden Elektronen zur Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen mit Wassermolekülen bereitgestellt, wodurch der Kontaktwinkel von Wassertröpfchen verringert wird21 und die Emission von Qdots beeinträchtigt werden kann (siehe unten).

Derzeit ist der genaue Mechanismus der abstandsabhängigen spektralen Änderung der Qdot-Emission der Glasoberfläche nicht bekannt. Allerdings könnte die Energieübertragung von Qdots auf die Glasoberfläche unsere experimentellen Beobachtungen erklären, wie sie für Qdots und Goldnanopartikel vorgeschlagen wurden14. Das abstandsabhängige Abschrecken in dieser Studie ist mit einem Förster-Prozess kompatibel. Die Dicke der Silanschicht wird auf 27,6 nm23 geschätzt, was in der Nähe des Bereichs der Energieübertragung liegt. Dieser Wert steht im Einklang mit unserer Beobachtung, dass eine Verschiebung von Qdots um 27 nm die Intensität der roten Emission veränderte, und wir stellten fest, dass diese Löschung reversibel war und wiederholt beobachtet wurde (Abb. 5C). Ähnliche spektrale Veränderungen wurden bei allen in dieser Studie verwendeten Qdots festgestellt, Qdot565, Qdot585, Qdot605, Qdot655 und Qdot705, was darauf hindeutet, dass die von der Oberflächenentfernung abhängigen Effekte auf den Qdot ein allgemeines Phänomen bei CdSe sein könnten (Qdot565, Qdot585, Qdot605 und). Qdot655) und CdTe (Qdot705) Kern-Qdots.

Photolumineszenz- und Photolumineszenz-Anregungsspektroskopie-Messungen von CdSe/ZnS-Nanokristallen (QD560)2 zeigen eine Photolumineszenzintensität zwischen 250 und 650 nm; für die Anregung (280 nm) werden drei Emissionspeaks bei 280, 400 und 560 nm beobachtet; Das heißt, die Photolumineszenzintensität nimmt um 400 nm und 280 nm zu, und diese Peaks sind weniger deutlich und stammen vermutlich aus der Emission der ZnS-Schale und des Kern-Schale-Systems2. Photolumineszenzspektren von QD655 (d. h. CdSe/ZnS-Nanokristall) für verschiedene Anregungswellenlängen, die einen Hauptpeak bei 655 nm und weniger klare Peaks bei 450 nm zeigen; Ähnliche Photolumineszenzspektren von QD565 wurden ebenfalls erhalten (ergänzende Abbildung S2). Die Abnahme der Amplitude des 655-nm-Peaks (Bandkantenemission) hat keinen Einfluss auf die Amplitude der Emission zwischen 545 und 600 nm (Abb. 1A), was darauf hindeutet, dass der Ursprung der Emission zwischen 545 und 600 nm nicht davon abhängt auf der Bandkantenemission. Der Ursprung der Emission zwischen 545 und 600 nm ist derzeit nicht genau bekannt, es lohnt sich jedoch, die Möglichkeit vorzuschlagen, dass Qdots (QD560, QD565 und QD655) den ähnlichen Emissionsmechanismus von ZnS-Schale und Kern-Schale-System2 nutzen, was darauf hindeutet Der Anstieg der Photolumineszenzintensität bei kürzeren Wellenlängen (ca. 550 nm) in Abb. 1A könnte auf die komplexe Emission der ZnS-Schale und des Kern-Schale-Systems zurückzuführen sein.

Es kann auch erwähnenswert sein, dass das durch die Hydroxylierung bereitgestellte Elektron die Emissionsspektren von Qdots beeinflussen kann, wie in der vorherigen Studie3 vorgeschlagen; Die Oberflächenhydroxylierung liefert Elektronen und löscht Qdots. Diese Idee steht im Einklang mit den folgenden Beobachtungen. Die Niederdruck-Plasmabehandlung verringerte die Intensität der 655-nm-Emission von Qdots auf dem Glas. Die Silanisierung der Glasoberfläche erhöhte sowohl den Kontaktwinkel der Wassertröpfchen als auch die Intensität der Emission bei 655 nm. Die Emissionsintensität einzelner Qdots bei 582 nm nahm leicht zu, wenn der Abstand verkürzt wurde, wahrscheinlich aufgrund der Zunahme der evaneszenten Feldintensität24, und der Elektronentransfer vom durch die Hydroxylierung bereitgestellten Elektron hat möglicherweise keinen Einfluss auf die Emission. Eine aktuelle Studie16 ergab, dass das Spektrum aus mehreren Komponenten besteht und bestimmte Komponenten selektiv durch den Elektronentransfer beeinflusst werden, andere jedoch nicht. Der Elektronentransfer von der Glasoberfläche könnte sich in dieser Studie auf die gleiche Weise auf Qdots auswirken; Die 655-nm-Emission wird durch den Elektronentransfer beeinflusst, die 582-nm-Emission jedoch nicht. Es werden auch verschiedene Mechanismen für Spektrumsänderungen in Qdots vorgeschlagen5,16,29. Es könnte sich lohnen, hinzuzufügen, dass die durch Molekulardynamiksimulationen geschätzte Ionendichteverteilung exponentiell mit der Entfernung von der Oberfläche (einige nm) abnimmt30, was darauf hindeutet, dass die Ionendichte möglicherweise nicht für den beobachteten Rückgang der roten Emission verantwortlich ist.

In 5 mm große Quadrate geschnittenes Deckglas (Nr. 1S, 40 × 50 mm: Matsunami-Glas) wurde einer Plasmabehandlung (0, 1, 3, 10, 30, 90 s) unter Verwendung eines Tisch-Niederdruck-Plasmabehandlungssystems (YHS) unterzogen -R: Sakigake Semiconductor, Japan), um Staub und Schmutz von der Deckglasoberfläche zu entfernen und die Oberfläche zu hydrophilieren.

Die Glasoberfläche wurde mit Dimethyldichlorsilan silanisiert; Die Glasoberfläche wurde 5 Minuten lang bei 60 °C mit 0,01 bis 10 % 3-(Triethoxysilyl)propylisocyanat (Wako, Japan) und 10 mM Essigsäure in 50 % Ethanol behandelt.

Es wurden fünf verschiedene kommerziell erhältliche Kern-Schale-Qdots verwendet; Qdot565, Qdot585, Qdot605, Qdot655 und Qdot705 mit einer ZnS-Hülle und einem CdSe-Kern (Qdot565, Qdot585, Qdot605 und Qdot655) bzw. CdTe-Kern (Qdot705) (Invitrogen, USA). QD655 und QD705 wurden mit Streptavidin markiert. Qdot655 (ca. 10 nm Längsachse und ca. 5 nm Durchmesser)27 wurde 10-fach verdünnt und 2,5 μl Qdot655-Lösung wurden auf die Glasoberfläche getropft. Die Spektren der Qdots wurden nach dem Verdampfen des Wasserlösungsmittels (10 min) mit einem FP-8200-Fluoreszenzspektrophotometer (ausgestattet mit einer Ein-Tropfen-Messeinheit, JASCO Corporation, Japan) mit einer Anregung von 460 bis 530 nm untersucht (Abb. 1) und Emissionsbandbreiten von 5 nm bei 25 °C. Als mit demselben Fluorophotometer Emissionsspektren eines plasmabehandelten Glasstücks allein ohne Qdots gemessen wurden, wurde keine Emission festgestellt, obwohl 5 % des Anregungslichts an der Oberfläche des Glases reflektiert und an der Oberfläche leicht gestreut wurden. Dies impliziert, dass die Photolumineszenzintensität bei kürzeren Wellenlängen (ca. 550 nm) zunimmt und mit dem Fluoreszenzspektrophotometer erfolgreich nachgewiesen werden konnte.

Der Kontaktwinkel der Glasoberfläche und der Kante eines Wassertropfens vor und nach der Niederdruck-Plasmabehandlung wurde mit einem horizontal platzierten Fernglas (Leica, MZ9s) und einer CCD-Kamera (Wraymer, FLOYD-2A) gemessen. Das Messprinzip ist in Abb. 2 dargestellt. Der Kontaktwinkel Theta (θ) wird durch Messung des Tropfendurchmessers (2 × r) und der sphärischen Kronenhöhe (h) gemäß der folgenden Gleichung berechnet, wie von21 erwähnt;

\({\uptheta } = 2 \cdot \tan^{ - 1} \theta 1\) und \(\tan \theta 1 = {\text{h}}/{\text{r}}.\)

Ein inverses Nikon-Mikroskop (Ti2), ausgestattet mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur (Nikon Plan 100 × NA 1,49), einem Quad-Band-Erreger (Semrock, FF01-390/482/532/640–25) und einem dichroitischen Spiegel (Semrock, Di03-R405). /488/532/635-t1-25 × 36), Bandpassfilter (Semrock, FF01-446/510/581/703-25) und das perfekte Fokussystem (PSF-2) wurden verwendet, um einzelne Qdots auf dem modifizierten Bild abzubilden Glasoberfläche. Zur Beleuchtung von Qdot655 wurde ein Feststoffdiodenlaser (532 nm, CNI-Laser Changchun, China) verwendet. Der Qdot wurde 103-fach mit DW und β-Mercaptoethanol (10 mM) verdünnt, auf die Glasoberfläche getropft und mit einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop beobachtet, das durch W-View (Hamamatsu Photonics, Japan) geleitet und mit Zweibandpassfiltern ausgestattet war (Semrock, FF01-582/64 und Semrock, FF02-675/67) und auf eine iXon Ultra 897 CCD-Kamera (Andor, UK) projiziert. Für die schnelle Bildaufnahme wurde 4×4-Binning auf das Vollbild angewendet, und die tatsächliche Größe jedes Pixels betrug 640 x 640 nm. Der in dieser Studie verwendete einzelne Qdot zeigte eine einstufige Löschung, wie in der ergänzenden Abbildung S3 gezeigt, was den Nachweis einzelner Qdots bestätigt. Die Längsachse jedes Qdot27 ist unterschiedlich und wird durch das polarisierte Laserlicht entlang der y-Achse beleuchtet, das den Qdot am effektivsten anregt, wenn die Längsachse des Qdot an der y-Achse ausgerichtet ist, und weniger effektiv, wenn sie an der x-Achse ausgerichtet ist. Achse26. Aus diesem Grund ist die Intensität einzelner Qdots in den Abb. 3 und 4 ist unterschiedlich. Ein linearer Biegeaktor (P-603-sS1, PI Deutschland) oder ein zylindrischer Piezoaktor (Durchmesser 5 mm, Länge 25 mm, Fuji Ceramics Corporation, Japan) wurde verwendet, um die Glasspitze (Durchmesser 1 µm) mit Qdots zu verschieben, wie in dargestellt Abb. 5 für den Versuchsaufbau. Der lineare Biegeaktor und der zylindrische Piezoaktor wurden verwendet, um Qdots mit 27,7 nm und 60 nm jede Sekunde wiederholt nach oben und unten zu bewegen, wobei dreieckige Wellensignale mit einem Hz verwendet wurden. Die Lichtstreuung von Qdots wurde durch den Filtersatz (Semrock, der obige dichroitische Spiegel, den Bandpassfilter) und den Satz in W-Ansicht (Semrock, FF640-FDi0 1–25 × 36, FF01-582/64 und FF02-) vollständig blockiert. 675/67). Die Einzel-Qdot-Bildgebung wurde eingesetzt, um die Möglichkeit einer Kontamination der Qdots unterschiedlicher Größe mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften auszuschließen, was die Interpretation experimenteller Daten von Ensemble-Qdots häufig komplex und schwierig macht.

Rhodamin-markiertes Kaninchen-Skelettmuskel-Actin (93 % nicht markiert: 6 % Rhodamin-markiertes Actin: 1 % Biotin-markiert, Cytoskeleton Inc. US) in einer Menge von 0,42 mg/ml wurde in F-Puffer (100 mM KCl, 2) polymerisiert mM MgCl2, 0,2 mM ATP, 0,1 mM DTT, 10 mM Hepes (pH 7,5) und β-Mercaptoethanol (10 mM) für 12 Stunden bei 4 °C, 104- bis 106-fach verdünnt unmittelbar vor dem Experiment.

Die mit Plasma behandelte Glasoberfläche (30 s) wurde mit Anti-Biotin-Antikörper (100 μg/ml) konjugiert, durch PLL-PEG(2) (1 mg/ml, SuSoS, Swiss) blockiert und zuvor mit F-Puffer gewaschen verwenden. Die Aktinfilamente wurden auf die Glasoberfläche gelegt und die nach dem Waschen mit F-Puffer am Substrat befestigten Aktinfilamente wurden zur Analyse verwendet. Die Filamente waren in Abständen von etwa 1 µm18 mit dem Substrat verbunden.

Ein mit Streptavidin konjugiertes Qdot655 wurde an die Aktinfilamente (1–5 µm) gebunden und sie wurden an die mit Anti-Biotin-Antikörpern konjugierte Glasoberfläche gebunden (Abb. 6). Bilder wurden alle 100 ms aufgezeichnet. Rhodaminmarkiertes Aktin (Cytoskeleton Inc. US) wurde verwendet, da Rhodamin unter unserer Bedingung schneller gelöscht wurde als Qdots, was mehr Chancen bot, Bilder von einem Qdot auf einem einzelnen Aktinfilament zu erhalten. Die statistische Analyse wurde mit der Software Origin Pro2020 durchgeführt. Die Zeitrafferaufnahme erfolgte nach der Löschung der Rhodamin-Fluoreszenz.

Die Daten, die den Befund dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Chihiro Matsumoto, Hiroyuki Ozaki, Hiroshi Okamoto, Naomi Hatta, Shigeki Okubo, Okiya Fujita, Daiki Yagi, Masahiro Saito und Amu Morikawa (Kanazawa Institute of Technology) für ihre Hilfe bei der Analyse der Fluoreszenzdaten. Dr. Hiroaki Hirata für die kritische Lektüre der frühen Version dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde teilweise durch Grant-in-Aid 15K07025, 18K0616700 und 21K06102 vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, JP18gm5810021h0003 von Advanced Research & Development Programs for Medical Innovation und der Nakatani Foundation unterstützt ( nach HT).

Abteilung für Angewandte Biowissenschaften, Kanazawa Institute of Technology (KIT), Yatsukaho 3-1, Hakusan-shi, Ishikawa, 924-0838, Japan

Kaoru Okura & Hitoshi Tatsumi

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KO und HT haben Experimente entworfen und durchgeführt und die in den Abbildungen gezeigten Daten analysiert. 1, 2, 4, 5 und 6 und schrieb die Arbeit.

Korrespondenz mit Hitoshi Tatsumi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Okura, K., Tatsumi, H. Die oberflächenabhängige Löschung der Qdot-Emission kann ein neues Werkzeug für hochauflösende Messungen sein. Sci Rep 13, 1869 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28910-8

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Eingegangen: 09. November 2022

Angenommen: 27. Januar 2023

Veröffentlicht: 01. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28910-8

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